亲和层析法纯化抗体 试验原理 如图所示，亲和层析的高度选择性使得从某一初始材猜中纯化富集一含量低的意图蛋白成为可能，因而亲和层析是蛋白质别离纯化进程中最有用的办法。别的，穴位配基蛋白质的亲和才能很强，也可一同进行样品的浓缩。 尽管大都情况下不需求将抗体与其他血清蛋白分隔，但穴位一旦需求，蛋白A亲和层析是一种很有用的别离办法。蛋白A是从Staphylococcus aureus中取得，可与抗体重链的Fc片段相结合。现在已知蛋白A可与多种哺乳动物的IgG相结合也可与某些IgMIgA相结合。穴位将蛋白A与固相载体相连，例如sepharose CL-4B，这种填料能成为别离和纯化不一样，不同亚类抗体或抗体片断的重要东西。 试验资料 ⒈.试验仪器 蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；离心管；离心机；pH试纸；过滤器；玻璃柱。 .试验试剂 TBS缓冲溶液 Tris (50 mM), 8.78g NaCl (150 mM)以及0.5g叠氮化钠0.05%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调理pH 7.4。 中和缓冲溶液： Tris (1 M), 87.8g NaCl (1.5 M), 0.37g EDTA (1mM)及5g叠氮化钠0.5%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调理pH8.0。 洗脱缓冲溶液(pH2.7)：甘氨酸50 mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调理pH 2.7。 洗脱缓冲溶液(pH1.9)：甘氨酸50 mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调理pH 1.9。 【试验办法 ⒈ 预备蛋白A sepharose CL-4B亲和柱 一般预备5ml或10 ml蛋白A sepharose CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，拌和。抽线分钟以除掉填猜中的气泡，否侧在柱中构成的气泡影响柱子的容量和别离作用。将蛋白A sepharose CL-4B填料缓慢参加玻璃柱中，使用泵操控填充速度为1 ml/分-2 ml/分，避免柱干使用10倍于床体积并通过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子 ⒉ 制备抗血清 将抗血清放入冰水或4°C冰箱中缓慢冻结以避免蛋白质的集合。在蛋白质冻结进程中呈现的集合可通过37°C预热而溶解。参加叠氮化钠至浓度为0.05%，4°C15,000xg离心5分钟，移出弄清的抗血清再通过滤器过滤除掉剩余的脂。 亲和层析 将抗体用缓冲溶液以1：5的份额进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5 ml的速度将抗血清上到柱上为确保抗血清与填料的结合，接连上柱2次并保存上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm0.008后加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至一切蛋白均流下来。用现已参加100ul中和缓冲溶液的1.5 ml E管分担搜集洗脱液，用pH试纸查看洗脱液的pH，穴位低于7可使用中和缓冲液调至约pH7.4以避免的变性。 在柱中参加10ml

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